克隆形成

（1）实验介绍

克隆形成及细胞克隆接种存活率，通过观察单细胞集落形成情况，来计算克隆形成率，了解其增殖能力。

（2）应用简介

克隆形成及细胞克隆接种存活率，通过观察单细胞集落形成情况，来计算克隆形成率，了解其增殖能力。

（3）技术原理

单个细胞在体外持续增殖6代以上时细胞数量已达60个左右，此细胞群体成为克隆或集落，大小在1.0-2.0 mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力，各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖率和对生存环境的适应性。软琼脂培养或平板克隆是最常用的方法。

（4）实验方法

Step1：细胞培养，调整细胞状态

Step2：制备单细胞悬液

Step3：按不同的细胞浓度梯度把细胞均匀接种于培养平板

Step4：培养一段时间

Step5：观察克隆情况，固定染色后计算克隆形成率

（5）技术总结

1）对数生长期，细胞状态良好的情况下，0.25%胰酶消化，离心后重悬时一定要吹打成单细胞悬液。可以选择6孔板作为克隆培养板，按密度梯度（如100、200、300）接种进孔板中。接种后切记晃动平板，使细胞分布均匀。

2）培养2周左右（出现肉眼可见细胞集落时），即可固定染色。加固定液和染色液时，覆盖住孔板底层即可。但如果长时间不处理，需增加液体量，防止液体干涸，影响拍照效果。

3）拍照时，务必使每个孔中无阴影，如无法达到，则逐个孔进行拍照。

（6）送检与交付标准